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比格犬三联高免血清制作与犬细小病毒抗体的检测

发布日期:2019-04-09 14:01:40 编辑:宠物狗介绍网阅读次数:

比格犬三联高免血清制作与犬细小病毒抗体的检测

作者:未知

  摘要以犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬传染性肝炎病毒(ICHV)的灭活强毒接种于7只基础免疫后的比格犬,接种10 d后检测犬体内血清的CPV抗体效价。对抗体效价大于或等于1∶1 280的犬,放血分离血清而得三联高免血清。试验结果为:把效价为1∶320的抗原用于试验的7只犬中,1~6号犬的血清效价均等于或大于1∶1 280,达到高免血清效价要求。而7号犬的血清效价为1∶640,小于1∶1 280,不符合试验要求。
  关键词比格犬;三联高免血清;细小病毒强毒;抗体水平检测
  中图分类号S858.292.5;S852.5;Q95-33文献标识码A文章编号 1007-5739(2011)09-0352-03
  
  犬细小病毒、犬瘟热和犬传染性肝炎是对犬危害较大的3种最常见的传染性疾病,而制作三联高免血清就是为了治疗、预防和控制这3种疾病的发生和流行。其中犬细小病毒(CPV)病是近年来发现的烈性传染病,以急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎为临床特征[1-4]。Eugster等(1977年)首先报道此病。1978年,美国、欧洲和澳大利亚几乎同时分离获得犬细小病毒,之后此病多次发生于世界许多国家和地区。我国梁士哲等(1982年)、朱雄正等(1983年)最早报道此病,目前已广泛流行于华东、华南、华北、东北、西南等地区,是危害我国养犬业最为严重的疾病。本文对所制作的三联高免血清的CPV抗体进行检测,目的在于检查实验犬场免疫程序的合理性及所用疫苗的效力,为固定免疫程序、有效降低犬细小病毒等传染病的发病率,最终为预防和控制这几种传染病提供科学依据。
  1材料与方法
  1.1三联高免血清的制作与使用
  1.1.1试验材料。供试动物:广东省中山市某实验犬场健康纯种比格犬,1雄6雌,共7只,均为6~7岁龄,并按1~7号的顺序编号。该实验犬场已确诊患细小病毒或以细小病毒病为主合并感染的1~3月龄病犬15只,其中10只(4雄6雌)处于疾病初中期,5只(3雄2雌)处于疾病后期。供试药物:灭活的犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬传染性肝炎病毒,由北京军事医学科学院提供;双抗[青霉素(80万U/瓶)和链霉素(100万U/瓶)],购自石家庄制药有限公司;犬瘟热、犬传染性肝炎、犬细小病毒病、犬副流感、腺病毒乙型感染、钩端螺旋体病的六联苗,美国富道动物保健集团出品。试验仪器:LG10-2.4A型高速离心机和低速离心机,北京医用离心机厂制造;三角锥瓶数个。
  1.1.2试验方法。一是对上述7只健康老龄比格犬驱虫、洗澡、隔离饲养,同时用双倍剂量(2 mL/只)六联苗作基础免疫。10 d后,用灭活的CPV、CDV、ICHV强毒攻毒,按8 mL/只的剂量分两侧肌注。攻毒10 d后,每只犬胫前静脉采血5 mL,置于离心机中以4 000 r/min离心15 min,分离出来的血清用于CPV抗体效价的检测。二是CPV抗体效价检测结果大于或等于1∶1 280的犬。于检测后第4天停食(照常供水),第5天在无菌环境下颈动脉放血,直至把血放完为止。犬血用数个灭菌三角瓶盛接,室温自然放置,待血清析出后,用灭菌安瓶分装血清,在1 mL血清中加入500~1 000 U的双抗后,把血清置于-10 ℃冷冻备用。三是治疗试验。把病犬隔离饲养并分成2组,处于疾病初中期的10只犬为一组;处于疾病后期的5只犬为另一组。同时颈部皮下注射自制三联血清8~10 mL/只,密切注意病犬的变化,以检测此三联高免血清的治疗效果。
  1.2犬细小病毒抗体效价的检测
  1.2.1试验材料。试剂:白猪猪血,采自中山市肉联厂;CPV抗原,购自北京军事医学科学院;红细胞保存液(阿氏液)的配置,葡萄糖2.05 g+枸橼酸钠0.80 g+枸橼酸0.055 g+氯化钠0.42 g,加蒸馏水至100 mL,然后过滤,以每4.54 kg分装,经15 min高压灭菌后,置0~4 ℃保存备用;0.15 moL/L pH值为7.2的缓冲液(PBS)的配制,甲液用Na2HPO4?12H2O 53.7 g加水至1 000 mL。乙液用NaH2PO4?2H2O 23.4 g加水至1 000 mL,使用时取甲液720 mL+乙液280 mL+生理盐水1 000 mL配成2 000 mL PBS,以每4.54 kg分装,灭菌后备用。主要仪器:LG10-2.4A型高速离心机和低速离心机;V型反应板(12×6个孔);水浴锅,由北京市医疗器械设备厂制造;移液器,由上海求精玻璃仪器厂制造。
  1.2.2试验方法。一是红细胞悬液的制作。①用事先加入适量抗凝剂的灭菌三角瓶盛接健康白猪的中断血,猪血和红细胞保存液以1∶10的量迅速摇匀,置4 ℃保存备用。采血后第3天用PBS进行洗血,共洗6次,前5次均以1 000 r/min的速度离心5 min,最后1次以1 500 r/min的速度离心10 min,然后把上清液吸去。②先制作一份50%的红细胞液(血球1 mL+PBS 1 mL):再制作1%的红细胞液[50%红血球1 mL+PBS 99 mL+BSA 100 mL(牛血清白蛋白)],置4 ℃保存备用。③抽待检动物血5 mL,以4 000 r/min的速度离心15 min,把分离出来的血清经56 ℃水浴30 min灭活,即为待检血清。然后把待检血清以1∶10的稀释度稀释(即PBS 0.4 mL+血清0.05 mL+50%血球0.05 mL)置4 ℃保存一夜,取上清液反应。二是抗原效价的测定。先把抗原以1∶10稀释(抗原20 μL+PBS 180 μL)。①加PBS。第1孔不加,从第2孔至12孔各加50 μL。②加抗原。第1孔加50 μL,第2孔加50 μL,以2倍的倍比稀释至11孔,弃去50 μL,第12孔不加抗原,作对照用。③加1%红细胞。从第12孔至第1孔各加50 μL,轻轻振荡,置4 ℃冷冻1.0~1.5 h,然后拿出放到冰板上,下面垫1张白纸,观察结果。④抗原效价的判定。50%红血球凝集的最高效价即为此抗原的凝集效价,用此效价除以16即为此抗原的稀释倍数,用以测定待测血清的效价。三是血清效价的测定。①加PBS。第1孔不加,第2孔至第11孔各加25 μL,第12孔加50 μL。②加待测血清。第1孔和第11孔各加25 μL,第2孔加25 μL,以2倍的倍比稀释至第10孔,弃去25 μL,第12孔不加血清,作为对照孔。③加抗原。从第10孔加到第1孔,每孔25 μL,第11、12孔不加。如此,即每孔均为50 μL。血清效价测定的具体操作情况见表1。④抗原对照。在反应板最后一排作抗原对照,抗原用前面加样后剩下的抗原。A为加PBS。第1孔不加,第2至8孔各加50 μL,(也可做至最后一孔即12孔)。B为加抗原。第1孔加50 μL,第2孔加50 μL,倍比稀释至最后一孔(第8孔),弃去50 μL。⑤所有样品与抗原对照做好后,摇匀,放到37 ℃的恒温箱内放置30 min然后取出来从后往前加1%血球,每孔加50 μL,摇匀,置4 ℃冷冻1.0~1.5 h,然后取出观察结果。⑥血清效价判定。100%血球不凝集的血清最高稀释倍数即为待检血清的血凝抑制滴度,即血清效价。⑦抗原对照孔判定。观察1 U血凝素孔是否为50%凝集,以判断抗原效价测定是否准确,如有相差两孔,则要重新测定抗原效价。抗原对照正常表现见表2。
  2结果与分析
  2.1血清制作与使用效果
  经血凝试验检测其血清中CPV抗体效价等于或大于1∶1 280的犬,每只犬可分离出400 mL左右的三联高免血清。在注射三联高免血清后的2~3 d,处于疾病初中期的10只病犬有9只犬精神状态明显好转,采食量逐渐恢复正常;另一只犬也开始进食但精神状态仍欠佳;5~6 d后10只犬基本痊愈。而处于疾病后期的5只犬注射后虽有采食但量少,没有特别明显的好转迹象。
  2.2抗原效价测定
  抗原效价判定结果见表3,血清效价判定见表4。50%红血球凝集的最高效价是1∶320。用于试验的7只犬中,1~6号试验犬体内CPV抗体效价均等于或大于1∶1 280,而7号犬体内CPV抗体效价为1:640(表5)。抗原对照试验的结果是:1 U血凝素为50%凝集(表6)。
  3结论与讨论
  抗原测定的结果表明:50%红血球凝集的最高效价为1∶320,即此抗原的凝集效价是320,用320除以16等于20,即此抗原的稀释倍数应为20。7只试验犬中,其中有6只犬的体内CPV抗体效价大于或等于1∶1 280,因此从这6只犬的体内得到的血清是符合试验要求的;而另外剩下的1只试验犬其CPV抗体效价为1∶640,低于1∶1 280,不符合试验要求,应补攻强毒,10 d后再检测其CPV抗体效价,根据其效价而作相应处理。
  抗原对照试验中,1 U血凝素为50%凝集(++),所以该抗原效价的测定结果是正确的,即抗原的稀释倍数是正确的,从而测定处理的血清效价是正确的。所制的三联血清符合试验要求。
  在整个试验操作过程中,若以下操作做得不好就有可能影响试验结果:放血前,应对试验犬先进行全身按摩后进行心脏按摩;放血时速度要慢;装血的三角锥瓶瓶底血层薄血清析出才完全,不加防腐剂。红细胞的制作过程中,采血时应注意无菌操作;洗红细胞时要注意是否有溶血或凝血,如有即是采血不好或有自凝现象,应弃掉;吹起血球时应避免起泡;配制1%红血球时加入牛血清白蛋白,目的是使红细胞均匀下沉;而50%红血球作用则在于吸收血清中的杂质。在血清效价的测定中,观察凝集时,可以把反应板竖起,如果血球迅速全部流下成一直线,即为完全不凝集;如果有少量流下或流下速度较慢,即为有凝集;如果完全没有流下,即为完全凝集。
  过去该实验犬场曾采用国内外好几种血清抗体,治疗时还配合抗生素疗法,但对该场的细小病毒病的防治效果都不明显,因此决定自制血清三联高免血清用于临床治疗犬细小病毒病或以犬细小病毒为主的合并感染性疾病[5-6]。结果表明:CPV抗体效价大于或等于1∶1 280的三联高免血清对于发病初中期的CPV、CDV、ICHV 3种传染性疾病同时配合清热解毒药及抗生素疗法,治愈率可达到99%以上;而对处于发病后期的细小病毒病病犬,其作用则不很明显。但总的说来,该场细小病毒病的发病率和死亡率都显著下降。
  由于试验时间紧迫,且根据该实验犬场的实际情况,该场CPV病发病率和死亡率较高,危害大;而CDV合ICHV的发病率低、致死力弱。因此在制作三联高免血清时,只作了CPV抗体效价的检测而没作CDV和ICHV抗体效价的检测。据有关文献记载,血清中CPV抗体效价大于等于1∶1 280时,此三联高免血清对CPV病的预防和治疗效果较好。而本试验的治疗效果试验的结果也恰好证明了这一点。因此,将自制的CPV抗原以1∶20稀释作为抗原可应用血液凝集试验检测血清CPV抗体效价。对健康比格犬以进口六联苗做基础免疫,再以灭活的CPV、CDV、ICHV三联强毒株进行强化免疫,所获三联高免血清对犬细小病毒病的初中期病犬具有明显的治疗效果。
  4参考文献
  [1] 赵世华,孟宪龙,李向宇,等.犬细小病毒细胞毒蜂胶佐剂灭活抗原对山羊的免疫效果研究[J].畜牧与饲料科学,2010,31(10):175-176.
  [2] 孙宁.仔犬细小病毒病的母源抗体水平监测[J].畜牧与饲料科学,2009(10):71-72.
  [3] 王建飞,王晓明.PPA―ELISA检测犬细小病毒抗体方法的建立[J].实验动物与动物实验,1992(1):15-17.
  [4] 原元宣,季宇彬.用ELISA法检测犬细小病毒抗体[J].国外兽医学:畜禽传染病,1996,16(4):28-30.
  [5] 孙宁.母犬产前接种疫苗对犬细小病毒抗体效价的影响[J].上海畜牧兽医通讯,2009(2):54-55.
  [6] 刘雄伟,沈志敏,邵伟娟.犬三种病毒疫苗对实验犬的保护效价的测定[J].实验动物与比较医学,2005,25(2):113-114.
  注:本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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